寡聚β-环糊精键合聚合物固定相分离天然产物活性成分

【摘要】p-环糊精内疏水外亲水的性质以及特殊的分子结构,使其具有对客体分子凭借尺寸、几何形状和性质等差异进行识别和选择的能力。利用这种与特定客体分子形成包结络合物的能力,可将p-环糊精键合到合适的载体上,用于制备液相色谱固定相,提高介质的分离能力。寡聚环糊精能使单位体积的环糊精浓度得以增加,在相邻环糊精的协同作用下,可使单个环糊精分子难以分开的目标产物得以分离。本文将寡聚p-环糊精键合到目前分离植物天然产物常用的聚丙烯酸和聚苯乙烯吸附树脂或它们的多孔聚合物上,提高了它们对天然产物活性成分的分离效率,克服了p-环糊精键合天然多糖凝胶介质机械强度不高、不能耐受某些有机溶剂的缺点,得到的新型色谱分离介质,用于分离纯化葛根素等植物天然产物活性成分,取得了良好的分离效果。本文优化了制备的寡聚p-环糊精键合聚合物固定相分离纯化葛根素的工艺,对它们吸附保留葛根素的机理进行了探讨。本文还对寡聚p-环糊精键合凝胶介质分离纯化大豆苷和紫杉醇的工艺进行了研究。具体包括以下内容：选取生物相容性好、机械强度高的三种聚丙烯酸类树脂作为骨架载体,对它们键合寡聚p-环糊精的制备方法和条件进行了研究。确定载体PGMA-MQ的键合时间为12h、PHEMA-MQ和D152为6h；载体PGMA-MQ的键合温度为60℃、PHEMA-MQ和D152为50℃；含NaOH的水溶液被确定为键合反应的溶剂系统；反应物的最佳投料摩尔比分别为1:1(PGMA:CDP),1:1(PHEMA:CDP),和1：1.5(D152:CDP)。制备的三种键合固定相装柱后分别对葛根黄酮进行色谱分离,经比较微球介质D152制备的D152-CDP键合介质分离纯化葛根素的效果最好,采用最适流动相7%乙酸水溶液以1.0mL/min流速等度洗脱,一次层析分离可使葛根素的收率为96.8%时,其纯度达到76.5%。对12种用作分离葛根黄酮的聚苯乙烯大孔树脂进行了寡聚p-环糊精固载化反应,静态吸附实验证明,键合寡聚p-环糊精后的大孔树脂对葛根素的吸附选择性有了明显提高。进一步通过吸附动力学实验和吸附平衡数据对Freundlich方程的拟合程度进行考察,筛选出大孔吸附树脂HPD-100经键合寡聚p-环糊精后得到的介质HPD-100-CDP,是所考察的聚苯乙烯大孔吸附树脂中最适合分离葛根黄酮的键合介质。为减小颗粒不均匀造成的分离效率的降低,选择经SPG膜乳化结合悬浮聚合法合成的多孔、尺寸均一的聚苯乙烯聚合物PS作为骨架载体,键合寡聚p-环糊精后制备的PS-CDP色谱柱在最适流动相甲醇／乙酸／水=5.0/6.6/88.4(v/v/v)条件下,一次色谱分离得到葛根素的纯度和收率分别为95.3%和86.7%。利用PS-CDP柱对溶剂萃取大豆异黄酮产品进行分离纯化,确定流动相为甲醇/0.1mMNH4AC=65.0/35.0时,大豆苷可与其他杂质可得到很好的基线分离,说明该介质对黄酮类物质分离纯化具有通用性。从热力学角度研究了寡聚p-环糊精键合介质PS-CDP吸附葛根素的机理。利用吸附实验测定聚苯乙烯载体PS和寡聚p-环糊精键合介质PS-CDP对葛根素的吸附等温线,吸附等温线数据显示PS-CDP对葛根素的吸附能力比聚合物载体PS强。将平衡吸附数据拟合Freundlich方程,拟合度在0.99以上,说明两介质吸附过程可以用Freundlich模型表示。经测定,两种介质在吸附葛根素的过程中,微分吸附焓的变化(AH)和吸附自由能(△G)的变化均为负值,说明吸附过程为自发进行的放热反应过程。比较实验浓度范围内PS和键合寡聚p-环糊精的介质PS-CDP对葛根素的微分吸附焓数值的大小,可以确定p-环糊精与葛根素之间形成的包络相互作用在葛根素的吸附和保留中起重要作用。本实验用NMR技术证明葛根素与p-环糊精形成了主客体分子包合物而且葛根素的C环嵌入了p-环糊精空腔内。模拟寡聚p-环糊精键合聚丙烯酸类介质D152-CDP与葛根素之间产生的弱相互作用,采用悬浮聚合法,以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯或二乙烯基苯为交联剂,以偶氮二异丁腈为引发剂,合成具有不同化学结构的多孔聚合物载体,键合寡聚p-环糊精后,进行葛根素的吸附实验。结果表明介质对葛根素的吸收率随它们之间弱作用的增加而提高,具有多种弱相互作用的P(GMA-DVB)-CDP介质对葛根素具有最高的吸附率。实验利用傅立叶红外光谱对葛根素与合成介质之间的相互作用进行分析、表征,进一步阐明了寡聚p-环糊精键合聚丙烯酸类介质吸附分离葛根素的机理。利用寡聚p-环糊精键合琼脂糖凝胶介质分离纯化大豆苷和紫杉醇。比较了凝胶介质烯内基SepharoseHP键合寡聚p-环糊精前后,对大豆异黄酮的分离能力,结果表明键合后的介质分离能力有了较大提高,在寡聚β-CD偶联烯丙基SepharoseHP色谱柱上采用最适流动相10%醋酸／甲醇=80.0/20.0(v/v)经一次色谱分离,从大豆异黄酮粗品中可制得纯度超过97%、收率超过95%的大豆苷。选择三种p-环糊精键合琼脂糖凝胶介质(环氧氯丙烷偶联β-CD的Superose12PG色谱柱、β-CD偶联到环氧活化的Sepharose6B色谱柱和寡聚β-CD偶联烯丙基SepharoseHP色谱柱)分离纯化紫杉醇,经过浸提、萃取以及碱性氧化铝层析初分离后的紫杉醇粗品,在寡聚β-CD偶联烯丙基SepharoseHP色谱柱上可得到分离纯化,在最适流动相甲醇/乙腈/水=32.0/20.0/48.0(v/v/v)等度洗脱条件下使紫杉醇的纯度达到90%以上。经电喷雾质谱鉴定分离得到的组分为紫杉醇。
【作者】杨丽；
【导师】谭天伟；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2008，博士
【关键词】寡聚β—环糊精；聚丙烯酸树脂；聚苯乙烯树脂；分离纯化；葛根素；固定相；键合凝胶介质；活性成分；

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